T2毒素檢測試劑盒使用說明書（酶聯(lián)免疫法）
 
1 原理及用途
T2毒素（T2）是由多種鐮刀菌產(chǎn)生的一種霉菌毒素。主要污染小麥、大麥、玉米等糧食作物及其制品，對人類健康及畜牧業(yè)構(gòu)成了較大危害。T2毒素主要影響血液，肝臟，腎臟，胰腺肌肉及淋巴細(xì)胞的功能，T2毒素中毒后的一般臨床癥狀為厭食、嘔吐、腹瀉、生長停滯、繁殖和神經(jīng)機(jī)能障礙等。使用T2毒素試劑盒則能夠快速而準(zhǔn)確的分析樣品中T2毒素殘留。
本試劑盒采用一步競爭ELISA方法檢測玉米、大米、豆類、花生、燕麥、飼料等樣本中的T2毒素，試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、辣根酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測時，酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被T2毒素抗原與樣本中T2毒素競爭抗T2毒素抗體(抗體工作液)，同時抗T2毒素抗體與酶標(biāo)二抗（酶標(biāo)記物）相結(jié)合，經(jīng)TMB底物顯色，樣本吸光值與其含有的T2毒素成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中T2毒素的含量。
2 T2毒素檢測試劑盒技術(shù)指標(biāo)
2.1 試劑盒靈敏度：0.2ppb(ng/ml)
2.2 反應(yīng)模式：25℃，30min～15min
2.3 檢測下限：
花生、玉米、燕麥、大豆、飼料等……………24ppb
小麥………………………………………………20ppb
 2.5 樣本回收率：
花生、玉米、燕麥、大豆、飼料等……………110±15%
小麥………………………………………………110±15%
3 試劑盒組成
酶標(biāo)板……………………………96孔 
濃縮標(biāo)準(zhǔn)液（黑蓋）：各1ml
0ppb、2ppb、6ppb、18ppb、54ppb、162ppb
酶標(biāo)記物…………………6ml
抗體工作液………………6ml
底物液A（白蓋）……………………6ml
底物液B（黑蓋）……………………6ml
終止液（黃蓋）………………………6ml
10X濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml
說明書………………………………1份
蓋板膜………………………………1份
自封袋………………………………1份
4 需要的器材和試劑
4.1 儀器：酶標(biāo)儀、打印機(jī)、均質(zhì)器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g）、漏斗、濾紙
4.2 微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl
4.3 試劑：甲醇、二氯甲烷 、去離子水
5 樣本前處理
5.1 樣本處理前須知：
實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實驗結(jié)果。
5.2 配液：
配液1：樣品提取液
用去離子水將甲醇按3∶2體積比進(jìn)行稀釋（例：30ml甲醇+20ml去離子水）。
5.3.1 花生、玉米、燕麥、大豆、飼料等樣品處理方法
1）取1g粉碎樣品，加入20ml樣品提取液；
2）劇烈振蕩5min；
3）用定量分析濾紙過濾；
4）用蒸餾水或去離子水按1∶5比例稀釋；
5）取50μl進(jìn)行分析。
稀釋倍數(shù)：120         檢測下限：24ppb
5.3.2 小麥樣品處理方法
1）取1g粉碎樣品，加入20ml樣品提取液；
2）劇烈振蕩5min；
3）用定量分析濾紙過濾；
4）取上清液1ml，加入2ml二氯甲烷，振蕩，4000r/min，離心5min，取二氯甲烷層，于50℃氮氣吹干；
5）加入5ml10%甲醇，振蕩混勻；
6）取50μl進(jìn)行分析。
稀釋倍數(shù)：100             檢測下限：20ppb
6 酶聯(lián)免疫試驗步驟
    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。
實驗開始前需：
配液A：洗滌工作液
將40ml 10×濃縮洗滌液用去離子水按1:9稀釋成400ml工作洗滌液備用，洗滌工作液在4℃環(huán)境可保存一個月。
制備T2毒素標(biāo)準(zhǔn)品：
標(biāo)準(zhǔn)品溶液（0ppb，0.2ppb，0.6ppb，1.8ppb，5.4ppb，16.2ppb）
取6個1.5ml離心管，把標(biāo)準(zhǔn)品濃縮液用去離子水稀釋10倍（如：450ul去離子水加入50ul 標(biāo)準(zhǔn)品濃縮液），現(xiàn)配現(xiàn)用。
6.1 編    號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
6.2 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標(biāo)記物50µl/孔，再加入50µl/孔的抗體工作液，用蓋板膜封板，輕輕振蕩5秒混勻，25℃反應(yīng)30分鐘。
6.3 洗    滌：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用工作洗滌液250µl/孔充分洗滌5次，每次間隔30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
6.4 顯    色：每孔加入底物液A 50µl，再加底物液B 50µl，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘。
6.5 終    止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。
6.6 測吸光值：用酶標(biāo)儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。
7 結(jié)果分析
7.1 百分吸光率的計算
    標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以*個標(biāo)準(zhǔn)液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即
 百分吸光度值（%）＝
A
×100%
A0
A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算
    以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實際濃度。
    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（索?。?br />8 注意事項
8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
8.3 混合要均勻，洗板要*，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的*性。
8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。
8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。
8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。
8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。
9 貯藏及保存期
儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。
保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。