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免疫熒光技術(shù)的操作方法流程
更新時間:2013-08-14   點(diǎn)擊次數(shù):2779次

 根據(jù)實驗室技術(shù)案例,以下為大家分享免疫熒光技術(shù)的操作方法流程。

免疫熒光技術(shù)(immunofluorescence,IF)是根據(jù)抗原-抗體反應(yīng)的原理,先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物,再用這種熒光抗體(或抗原)作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)。用免疫熒光技術(shù)顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)抗原物質(zhì)或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細(xì)胞(或組織)化學(xué)技術(shù)。

免疫熒光技術(shù)的操作流程:

(1)選取一抗時要來源于兩種不同的動物,我用的是來源于rabbit和rat的抗體,二抗則是不同熒光信號標(biāo)記的,我用的是donkey anti-rabbit-FITC(綠)和donkey anti-rat-Tex-Red(紅)。

(2)我的做法是兩種一抗同時孵育,然后兩種二抗同時孵育??贵w濃度、孵育時間要仔細(xì)摸索,我感覺一抗4度孵育過夜比較好,背景比較清晰。

(3)我的陽性對照用的是陽性組織切片,陰性對照則分別是家兔和大鼠的IgG,熒光標(biāo)記物對照是PBS+熒光標(biāo)記物。

(4)封閉血清與二抗來源動物一致,我用的是10%的正常donkey血清。

(5)其余步驟同一般免疫熒光單標(biāo)操作。

免疫熒光技術(shù)的使用方法:

(1)直接熒光法 將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上,直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。其優(yōu)點(diǎn)是方法簡便、特異性高,非特異性熒光染色少;缺點(diǎn)是敏感性偏低,而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。此法常用于細(xì)菌、病毒等病原微生物的快速鑒定。

(2)間接熒光法 用一抗與標(biāo)本中抗原結(jié)合,再用熒光素標(biāo)記的二抗染色。該法優(yōu)點(diǎn)是敏感度比直接法高,制備一種熒光素標(biāo)記的二抗即可用于多種抗原的檢查,但非特異性反應(yīng)亦增加。染色程序分為兩步,首先用未知未標(biāo)記的抗體(待檢標(biāo)本)加到已知抗原標(biāo)本上,在濕盒中37℃保溫30min,使抗原抗體充分結(jié)合,然后洗滌,除去未結(jié)合的抗體;然后加上熒光標(biāo)記的抗球蛋白抗體或抗IgG、IgM抗體。如果*步發(fā)生了抗原-抗體反應(yīng),標(biāo)記的抗球蛋白抗體就會和已結(jié)合抗原的抗體進(jìn)一步結(jié)合,從而可鑒定未知抗體。 由于免疫熒光技術(shù)的特異性、快速性和在細(xì)胞和分子水平定位的敏感性與準(zhǔn)確性,在動物檢驗檢疫方面得到了廣泛應(yīng)用。

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