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原代細胞的培養(yǎng):
原代細胞的培養(yǎng)是指直接從機體取下細胞、組織和器官后立即進行培養(yǎng)。因此,較為嚴格地說是指成功傳代之前的培養(yǎng),此時的細胞保持原有細胞的基本性質(zhì),如果是正常細胞,仍然保留二倍體數(shù)。但實際上,通常把第十代以內(nèi)的培養(yǎng)細胞統(tǒng)稱為原代細胞培養(yǎng)。
原代細胞的培養(yǎng)有組織塊培養(yǎng)和分散細胞培養(yǎng)。
組織塊培養(yǎng)是將剪碎的組織塊直接移植在培養(yǎng)瓶壁上,加入培養(yǎng)基后進行培養(yǎng)。
分散細胞培養(yǎng)大致步驟為:
將動物組織從機體中取出離散成單個細胞(常用),置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng),使細胞得以生存、生長和繁殖(注意整個過程無菌)。
原代細胞操作方法:
(1)取成年新西蘭大白兔,耳緣靜脈注射空氣處死后,取下兔子的雙腿,立即用75%乙醇浸泡。
(2)移入細胞房內(nèi),去除雙腿表面的皮毛及肌肉,剪取關(guān)節(jié)段,移至超菌工作臺內(nèi)。
(3)PBS洗滌數(shù)次,用手術(shù)刀或彎剪將關(guān)節(jié)表面的軟骨組織取下。
(4)軟骨組織塊靜置5min,棄去上層液體及懸浮組織,將軟骨組織剪成1mm3的大小。移到離心管中加3倍體積的0.25%,置入37℃的恒溫搖床中,振蕩消化15-20min;
(5) 4℃靜置5min;棄上清,PBS洗滌,去上清。加入0.2%膠原酶II,置入37℃的恒溫搖床中,振蕩消化2H;
(6)加入生長培養(yǎng)基終止消化,反復吹打后依次通過200目濾網(wǎng)。收集濾液,1200rpm離心8min,棄上清,用DMEM*培養(yǎng)基重新懸浮細胞, 放入37℃,5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng);
(7)細胞傳代后放入預置有薄骨片或蓋玻片的培養(yǎng)板中進行培養(yǎng)。細胞*展開后即可固定做原代鑒定。
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