1, 什么時(shí)候需要穩(wěn)定細(xì)胞株?
以下實(shí)驗(yàn),構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株而不是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染geng能滿足實(shí)驗(yàn)要求:
1),外源片段在分裂細(xì)胞中長(zhǎng)期(>2周)穩(wěn)定表達(dá)。雖然普通轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)一般只能保證2-4天的轉(zhuǎn)染和表達(dá)效率,但腺載體在多數(shù)分裂細(xì)胞中可以維持2-4周內(nèi)的高轉(zhuǎn)染效率和表達(dá)周期。而非分裂細(xì)胞,可以使用腺相關(guān)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)外源基因,因?yàn)橄傧嚓P(guān)載體在許多非分裂細(xì)胞中可以保持長(zhǎng)達(dá)1年的高效表達(dá)。
2),需要構(gòu)建使用誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng),這主要是由于:a),過表達(dá)基因或者干擾目的基因引起細(xì)胞毒性或者抑制細(xì)胞生長(zhǎng)等不利因素; b),目的基因的過表達(dá)或者干擾需要時(shí)空特異性。
3),希望控制目的基因過表達(dá)或者干擾的拷貝數(shù),以避免引入人為因素影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精-確性。構(gòu)建穩(wěn)定株可以幫助篩選拷貝數(shù)適量的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。
4),部分細(xì)胞種類,載體亦無法達(dá)到高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率,通過構(gòu)建穩(wěn)定株,達(dá)到外源片段的高效表達(dá)。
5),長(zhǎng)期在少數(shù)幾類細(xì)胞中研究幾個(gè)基因的功能,通過構(gòu)建穩(wěn)定株,可以大大降低頻繁轉(zhuǎn)染或者包裝的成本,也極-大方便實(shí)驗(yàn)研究。
6),部分蛋白穩(wěn)定性*,瞬時(shí)RNA干擾因?yàn)樽饔弥芷诙蹋荒芤种颇康幕虻谋磉_(dá),但無法去除已經(jīng)表達(dá)的目的蛋白,所以需要通過構(gòu)建穩(wěn)定株實(shí)現(xiàn)geng好的基因干擾效果。
7),需要往動(dòng)物體內(nèi)注射表達(dá)有外源片段的細(xì)胞。需要構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株,以防止注射入動(dòng)物體內(nèi)后,很快外源片段表達(dá)丟失。
8),細(xì)胞個(gè)體差異(同一類細(xì)胞,不同個(gè)體細(xì)胞基因組存在差異)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有干擾,需要構(gòu)建單克隆細(xì)胞株去除干擾。
9),需要將外源片段插入基因組中,比如基因敲除,基因插入突變篩選等修飾基因組的實(shí)驗(yàn)。
2, 什么時(shí)候不需要構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株?
以下實(shí)驗(yàn)不需要構(gòu)建穩(wěn)定株:
1),希望迅速觀察目的基因過表達(dá)或者干擾效果。例如在正式實(shí)驗(yàn)之前進(jìn)行的小規(guī)模預(yù)實(shí)驗(yàn)。
2),2-4天的瞬時(shí)表達(dá)已經(jīng)可以達(dá)到具體的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?,比如檢測(cè)兩個(gè)外源轉(zhuǎn)染的目的蛋白之間的相互作用,或者觀察某些細(xì)胞周期抑制,凋亡或細(xì)胞存活相關(guān)基因的細(xì)胞表型。
3),細(xì)胞個(gè)體差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有影響。體外培養(yǎng)非原代細(xì)胞,多為轉(zhuǎn)化細(xì)胞系或者癌細(xì)胞,細(xì)胞個(gè)體差異大,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或者使用/腺相關(guān)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)geng可以反映細(xì)胞群體行為。或者使用逆轉(zhuǎn)錄載體構(gòu)建混合穩(wěn)定株。