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ELISA技術(shù)中的抗原抗體反應(yīng)
更新時(shí)間:2019-11-06   點(diǎn)擊次數(shù):970次

抗體的結(jié)構(gòu) 
抗體是能與抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白 (immunoglobulin,Ig)。Ig分五類,即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。與免疫測(cè)定有關(guān)的Ig主要為 IgG和IgM。Ig由兩個(gè)輕鏈(L)和兩個(gè)重鏈(H)的單體組成。Ig的輕鏈?zhǔn)窍嗤?,?kappa;(kappa)和λ(Lambda )兩種型別。五類Ig的重鏈結(jié)構(gòu)不同,這決定了它們的抗原性也不同。IgG和IgM的重鏈分別稱為γ(gamma)鏈和μ(mu )鏈。 重鏈和輕鏈的 N端的氨基酸排列順序因各種抗體而異,稱為可變區(qū),分別用VH和VL表示。兩者構(gòu)成抗體的抗原結(jié)合部位,只與相應(yīng)的抗原決定簇匹 配,發(fā)生特異性結(jié)合(見圖),是抗體專一性結(jié)合抗原的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。 IgG可被木瓜蛋白酶分解為三個(gè)區(qū)段,其中兩個(gè)相同的區(qū)段稱抗原結(jié)合片段(Fab)。每個(gè)Fab都保存結(jié)合抗原的能力,但只有一 個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn),是單價(jià)的,與抗原結(jié)合后不出現(xiàn)凝集或沉淀。另一區(qū)段稱Fc段,無抗體活性,但具有IgG*的抗原性。 IgG可被胃蛋白酶分解為兩個(gè)片段,一個(gè)Fab雙體,稱F(ab)2,能和兩個(gè)相同的抗原結(jié)合;另一片段類似Fc,隨后被分解 成小分子多肽,無生物活性。 IgM是由五個(gè)單體組成的五聚體,含 10個(gè)重鏈和10個(gè)輕鏈,具有10個(gè)抗原結(jié)合價(jià),由于空間位置的影響,只表現(xiàn)為五個(gè)抗原結(jié)合價(jià)。IgM分子量約為900000, IgG分子量約為150000。 機(jī)體被微生物感染后,先產(chǎn)生 IgM抗體,然后產(chǎn)生IgG抗體。經(jīng)過一段時(shí)間,IgM抗體量逐漸減少而消失,而IgG抗體可長(zhǎng)期存在,在疾病*后可持續(xù)數(shù)年 之久。 IgM抗體一般為保護(hù)性抗體具有免疫性。

 

抗原抗體反應(yīng) 
可逆性 
抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過程是一種動(dòng)態(tài)平衡,其反應(yīng)式為: Ag+Ab→Ag·Ab 抗體的親和力(affinity)是抗原抗體間的固有結(jié)合力,可以用平衡常數(shù)K表示: K=[Ag·Ab]/[Ag][Ab] Ag·Ab的解離程度與K值有關(guān)。高親和力抗體的抗原結(jié)合點(diǎn)與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常適合,兩者結(jié)合牢固,不易解離。解離 后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性,因此可用親和層析法來提純抗原或抗體。在抗血清中,特異性的IgG抗體僅占總IgG中 的極小部分。用親和層析法提取的特異性抗體,稱為親和層析純抗體,應(yīng)用于免疫測(cè)定中可得到更好的效果。 

 

適比例 
在恒定量的抗體中加入遞增量的抗原形成抗體復(fù)合物(沉淀)的量見圖1-4。曲線的高峰部分是抗原抗體比例合適的范圍,稱為等價(jià)帶(zone of equivalence)。在等價(jià)帶前后分別為抗體過剩帶和抗原過剩帶。如果抗原或抗體極度過剩,則無沉淀物形成,在免疫測(cè)定中 稱為帶現(xiàn)象(zone phenomenon)??贵w過量稱為前帶(prezone),抗原地過量稱為后帶(postzone)。在用免疫學(xué)方法測(cè)定抗 原時(shí),應(yīng)使反應(yīng)系統(tǒng)中有足夠的抗體量,否則測(cè)得的量會(huì)小于實(shí)際含量,甚至出現(xiàn)假陰性。

 

特異性 
抗原抗體的結(jié)合實(shí)質(zhì)上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)之間。由于兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補(bǔ)關(guān)系,所以抗原 抗體反應(yīng)具有高度的特異性。例如乙肝病毒中的表面抗原( HBsAg)、e抗原(HBeAg)和核心抗體(HBcAg),隨來源于同一病毒,但僅與其相應(yīng)的抗體結(jié)合,而不與另外兩種抗體 反應(yīng)。抗原抗體反應(yīng)的這種特異性使免疫測(cè)定能在一非常復(fù)雜的蛋白質(zhì)化合物(例如血清)中測(cè)定某一特定的物質(zhì),而不需先分離待檢物 。 但是這種特異性也不是的。假使兩種化合物有著部分相同的結(jié)構(gòu),在抗原抗體反應(yīng)中可出現(xiàn)交叉反應(yīng)。例如:絨毛膜促性腺激素( hCG)和黃體生成激素(LH)均由α和β兩個(gè)亞單位組成,其結(jié)構(gòu)的不同處在β亞單位,而兩者的α亞單位是同類的。用hCG免疫 動(dòng)物所得的抗血清中含有抗α-hCG和抗β-hCG兩種抗體,抗α-hCG抗體將與LH中的 α酶位發(fā)生交叉反應(yīng)。在臨床檢驗(yàn)中,如用抗hCG抗血清作為ren娠診斷試劑檢定尿液中hCG,只能用于hCG濃度較高的試驗(yàn),否則 婦女生理性排泄入尿液中的微量LH將與之發(fā)生交叉反應(yīng)。因此在作為早孕診斷(敏感度應(yīng)達(dá)到50mIu/mlhCG)的實(shí)際中必須 應(yīng)用只對(duì)hCG特異的抗β-hCG,以避免與其它激素的交叉反應(yīng)的發(fā)生。

 

敏感性 
在測(cè)定血清中某一物質(zhì)的含量時(shí),化學(xué)比色法的敏感度為 mg/ml水平,酶反應(yīng)測(cè)定法的敏感度約為5~10μg/ml,免疫測(cè)定中凝膠擴(kuò)散法和濁度法的敏感度與酶反應(yīng)法相仿。標(biāo)記的免 疫測(cè)定的敏感度可提高數(shù)千倍,達(dá)ng/ml水平。例如,用放射免疫測(cè)定法或酶免疫測(cè)定法測(cè)定HBsAg,其敏感度可達(dá)0.1ng /ml。 

 

標(biāo)記的免疫測(cè)定 
如上所述,免疫測(cè)定是一種很敏感的測(cè)定方法,抗原抗體反應(yīng)后直接測(cè)定形成的沉淀或濁度,敏感度可達(dá) 5~10μg/ml,但在臨床檢驗(yàn)中,某些待測(cè)物在標(biāo)本中的含量遠(yuǎn)低于這一水平,因此要尋找增加敏感度的方法。標(biāo)記的免疫測(cè)定是 將檢測(cè)試劑中的抗原或抗體用可微量測(cè)定的物質(zhì)加以標(biāo)記,通過測(cè)定標(biāo)記物來提高敏感度。在放射免疫測(cè)定和酶免疫測(cè)定中,標(biāo)記物分別 為放射性核素和酶,后用測(cè)定放射性和酶活力來計(jì)算待檢物的量,敏感度可比直接測(cè)定沉淀物提高數(shù)百至數(shù)千倍。在標(biāo)記免疫測(cè)定中, 一般加入過量的標(biāo)記試劑以保證與待測(cè)物*反應(yīng)。以標(biāo)記抗體(Ab ※)檢測(cè)抗原(Ag)為例,反應(yīng)式如下: Ag+ Ab※ → AgAb>※+ Ab※ 

 

在反應(yīng)產(chǎn)物中有與Ag結(jié)合的Ab※和游離和Ab※ ,如不將兩者分離而測(cè)定標(biāo)記物,測(cè)得的結(jié)果將為兩者之和。因此,游離標(biāo)記物與結(jié)合標(biāo)記物的分離是標(biāo)記免疫測(cè)定中的重要步驟??刹?用多種手段,固相載體是其中之一。如將抗原或抗體包被在固相載體上,然后再與標(biāo)記的抗原或抗體直接反應(yīng),結(jié)合的標(biāo)記物被固定在載 體上,而游離的標(biāo)記物留于溶液中。這樣可以通過洗滌將游離的Ab ※除去,結(jié)合標(biāo)記物的測(cè)定可在固相上進(jìn)行。 

 

酶免疫測(cè)定 
酶免疫測(cè)定(enzyme immunoassay)可分為均相(homogenous)和非均相(heterogenous)兩種類型。在均相EIA中可 不需進(jìn)行游離的和結(jié)合的標(biāo)記物的分離而直接測(cè)定標(biāo)記物。例如在某種條件下,抗原抗體反應(yīng)后形成的酶標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物中的酶失去 其對(duì)底物作用的活力,因而測(cè)出的酶活力直接反映游離的酶標(biāo)記物。均相EIA在臨床檢驗(yàn)中較少應(yīng)用。非均相EIA需行游離的和 結(jié)合的標(biāo)記物的分離。如前所述,固相載體可用作一種分離手段。這種固相酶免疫測(cè)定方法在1971年初建立時(shí)稱為酶聯(lián)免疫吸附劑 測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay),簡(jiǎn)稱ELISA,在國(guó)內(nèi)有譯作酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的,雖然含義不*確切,但已習(xí)用。

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