細胞株的保存方法
1.紫外消毒30min后封閉紫外燈,開啟超凈臺正常作業(yè)狀況,用酒精消毒操作者的雙手。
2.將所需的培育基,胰酶確保瓶身潔凈后放于作業(yè)臺面內(nèi),點燃酒精燈,將培育基和胰酶瓶口用酒精棉球擦洗后,再將瓶口對準在酒精燈上消毒2-3次,旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋,分別放于酒精燈的兩邊。特別是將培育基瓶放于斜架上,瓶口對準酒精燈,且放在間隔酒精燈zui近的位置,瓶蓋置于酒精燈的另一側(cè)。
3.將培育瓶瓶口在酒精燈上消毒2-3次,旋開后分別再次消毒瓶口和瓶蓋2-3次,蓋放于酒精燈右側(cè)后將培育瓶內(nèi)的培育液懸空倒進污缸,在酒精燈消毒2-3次瓶口,豎直放好。取1ml移液器快速移動在酒精燈上消毒1-2次,然后再裝上槍頭汲取1.5ml胰酶液,懸空移入培育瓶內(nèi)。
4.將培育使胰酶浸沒整個瓶壁的細胞層,計時約40s,立馬豎起對著燈光可觀察到細胞與細胞之間有zhen孔樣縫隙,并有1-2個細胞掉落,這時為胰酶消化的zui適時機。若看到成片的細胞從瓶壁掉落為胰酶消化過度;若看不到zhen孔樣縫隙和細胞掉落,則需持續(xù)消化,悄悄的敏捷平放培育瓶使胰酶浸沒細胞層1s后敏捷豎起對著燈光觀察細胞情況,可反復(fù)幾回,直至出現(xiàn)zhen孔樣縫隙和1-2個細胞掉落的消化狀況。用移液器將胰酶吸凈。
5.汲取1ml細胞凍存液于培育瓶內(nèi),并用移液器汲取少數(shù)的培育基輕柔的反復(fù)沖洗培育瓶壁5-8次,使貼壁細胞*掉落于培育基內(nèi)再悄悄吹打2-3次,使細胞盡可能處于單個懸浮狀況。
6.將1ml含有細胞的凍存液移入新的保種管內(nèi),擰緊瓶蓋,做好試驗符號。
7.將培育基瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊,熄滅酒精燈,收拾試驗臺面,取出試驗試劑及污缸等,封閉超凈作業(yè)臺。
8.將保種管先放于4℃冰箱 30min后拿出放置-20℃冰箱過夜,次日再放于-80℃的冰箱內(nèi)3-4天,zui后存放于-196℃的液氮灌內(nèi)長期保存。
注此進程也可簡化因?qū)嶋H操作進程中經(jīng)歷所得:步驟7結(jié)束后將保種管用干脫脂棉包裹后膠帶封好直接放于-80℃冰箱內(nèi)4-5天,即可放于液氮灌保存。但-80℃冰箱也可保存細胞株2-3月。
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