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細(xì)胞組織塊培養(yǎng)法
更新時(shí)間:2019-05-31   點(diǎn)擊次數(shù):1820次

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一、目的

 

     學(xué)習(xí)原代培養(yǎng)方法,從供體取得組織細(xì)胞后在體外進(jìn)行的培養(yǎng)。

 

二、概述

 

     組織塊培養(yǎng)法是常用的、簡便易行和成功率較高的原代培養(yǎng)方法。可以采用剪切法,即將組織塊剪切成小塊后,接種于培養(yǎng)瓶,組織小塊貼壁24h或更長時(shí)間后,細(xì)胞就從組織四周游出。但由于在反復(fù)剪切和接種過程中對(duì)組織塊的損傷,并不是每個(gè)小塊都能長出細(xì)胞。用于組織塊培養(yǎng)的培養(yǎng)瓶可根據(jù)不同細(xì)胞生長的需要作適當(dāng)處理,如預(yù)先涂以膠原薄層,以利于上皮樣細(xì)胞等的生長。(本節(jié)以新生牛主動(dòng)脈平滑肌培養(yǎng)為例)

 

三、材料

 

(一)儀器

 

1.凈化工作臺(tái)

2.恒溫水浴箱

3.冰箱(4℃、-20℃)

4.倒置相差顯微鏡

5.培養(yǎng)箱

 

(二)玻璃器皿

 

1.培養(yǎng)皿(Φ100mm)

2.吸管(彎頭)

3.燒杯(500ml、200ml、10ml)

4.廣口試劑瓶(500ml)

5.玻璃瓶(250ml、100ml)

6.培養(yǎng)瓶

7.廢液缸

 

(三)塑料器皿

 

1.吸頭

2.槍頭

3.膠塞

4.EP管

 

(四)其他物品

 

1.微量加樣槍

2.眼科組織剪(直尖、彎)

3.眼科組織鑷(直、彎)

4.12.5cm組織鑷(無鉤、1×2鉤)

5.25cm敷料鑷(無鉤)

6.止血鉗(18cm直紋式、12.5cm直紋式、彎紋式)

7.解剖剪

 

(五)試劑

 

1.D-Hanks液

2.小牛血清

3.RPMI1640

4.雙抗(青霉素、鏈霉素)

5.1N HCl

6. 7.4%NaHCO3

 

四、操作步驟

 

1.取材:打開胸腔,無菌操作下取出主動(dòng)脈胸段,浸到預(yù)先配制好的含雙抗(500u/ml青、鏈酶素)的D-Hanks液中漂洗。                                                                                                                               

2.組織的沖洗、修剪:取出主動(dòng)脈,用鋒利的剪刀修剪除去周圍組織,再用D-Hanks沖洗主動(dòng)脈3次,除去血kuai及雜組織等。

3.平滑肌組織分離:縱向剖開主動(dòng)脈,撕下主動(dòng)脈內(nèi)層,取主動(dòng)脈中層的平滑肌組織,無血清RPMI1640漂洗3次。

4.剪切:將平滑肌組織用鋒利的眼科剪反復(fù)剪切至剪成1mm3小塊,在剪切過程中,可以適當(dāng)向組織中滴加1~2滴培養(yǎng)液,以保持濕潤。

5.貼塊:將剪切好的組織小塊,用眼科鑷送入培養(yǎng)瓶內(nèi),用彎頭吸管將組織塊均勻擺置,每小塊間距0.5cm左右,組織塊放置好后,輕輕將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn),讓瓶底朝上,向瓶內(nèi)注入適量含10%牛血清培養(yǎng)液,蓋好瓶蓋。

6.培養(yǎng):將培養(yǎng)瓶瓶底朝上,37℃培養(yǎng)箱放置2~4h,待組織小塊貼附后,將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)平放,靜置培養(yǎng)。

7.換液:原代培養(yǎng)3~5d,需換液一次,去除漂浮的組織塊和殘留的血細(xì)胞。   

      組織塊培養(yǎng)法也可不用翻轉(zhuǎn)法,即在擺放組織塊后,向培養(yǎng)瓶內(nèi)僅加入少量培養(yǎng)液,以能保持組織塊濕潤即可,蓋好瓶蓋,放置37℃培養(yǎng)箱24h再補(bǔ)加培養(yǎng)液。

 

注意事項(xiàng)

 

1.取材的組織盡快培養(yǎng)。因故不能即時(shí)培養(yǎng),可將組織浸泡于培養(yǎng)液內(nèi),放置于冰浴或4℃冰箱中,如果組織塊很大,應(yīng)切成1cm3以下的小塊再低溫保存,但時(shí)間不能超過24h。

2.從消化道、周圍有壞死組織等污染因素存在的區(qū)域取材,可用含500~1000u/ml的青、鏈霉素BSS液漂洗5~10min,或用10%達(dá)克寧注射液沖洗浸泡10min再作培養(yǎng)。

3. 組織塊不易貼壁,可預(yù)先在瓶壁涂薄層血清、胎汁或鼠尾膠等。

4. 原代培養(yǎng)的1~2d內(nèi)要特別注意觀察是否有細(xì)菌、霉菌的污染,一旦發(fā)現(xiàn),要及時(shí)清除。

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