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一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備工作：

1、培養(yǎng)瓶的包被：包被液如多聚賴氨酸（PLL，ScienCell品牌，貨號(hào)0403或0413）或纖維粘連蛋白（BPF，ScienCell品牌，貨號(hào)8248），以無菌水稀釋至2 ug/cm2的濃度包被培養(yǎng)瓶。37度孵箱1小時(shí)或4度過夜，從包被好的培養(yǎng)瓶中回收多聚賴氨酸，并用無菌水洗滌培養(yǎng)瓶2遍。包被好的培養(yǎng)瓶不要放置超過24小時(shí)，其中的包被液可吸出重復(fù)使用2-3次，注意不要污染。

2、*培養(yǎng)基的配置：以內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基（ECM，ScienCell品牌，貨號(hào)1001）為例，把配套的胎牛血清（FBS，ScienCell品牌，貨號(hào)0025）、生長(zhǎng)因子（ECGS，ScienCell品牌，貨號(hào)1052）和雙抗（P/S，ScienCell品牌，貨號(hào)0503）加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液（ECM，ScienCell品牌，貨號(hào)1001）中。重新貼好標(biāo)簽，并混勻培養(yǎng)基。

二、原代細(xì)胞復(fù)蘇方法：
1、從液氮中取出原代細(xì)胞冷凍管，迅速投入37～38 ℃水浴中，其間可以輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)胞，加快融化速度，大約需要1分鐘時(shí)間。
2、5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)基稀釋至原體積的10倍以上，加入培養(yǎng)瓶中，再用1ml培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞凍存管，保證細(xì)胞都被加入培養(yǎng)瓶中，靜置于孵箱，12-16小時(shí)后更換培養(yǎng)基（除去DMSO）。以后每2天換一次液，保證細(xì)胞狀態(tài)良好。

三、原代細(xì)胞傳代方法：酶消化法
當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70-80%左右可以傳代，傳代比例以1:2或1:3為佳。具體方法如下：
1、棄去培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基，用PBS洗滌培養(yǎng)瓶2遍，加入0.25%的胰酶消化液（Trypsin-EDTA，ScienCell品牌，貨號(hào)0103），以消化液能覆蓋整個(gè)瓶底為準(zhǔn)。37度孵育4分鐘左右，輕拍培養(yǎng)瓶側(cè)面，顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，直到80%細(xì)胞呈現(xiàn)圓形。
2、細(xì)胞消化好后，加入胰酶中和液（TNS，ScienCell品牌，貨號(hào)0113），并輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，形成細(xì)胞懸液，然后將細(xì)胞和培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘。

3、棄去上清液，以1-2ml新鮮培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞并吹打均勻，接種于包被好的新培養(yǎng)瓶中，瓶中已有10ml左右的培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天更換培養(yǎng)基。